、設(shè)備簡介

PE EnVision 2105 多標(biāo)記微孔板檢測系統(tǒng)，主要用于在微孔板上進(jìn)行光吸收、化學(xué)發(fā)光、熒光、時間分辨熒光、AlphaScreen以及熒光偏振等所有非放射性標(biāo)記技術(shù)檢測，具備的靈敏度、穩(wěn)定性、和檢測速度。

、設(shè)備參數(shù)與優(yōu)勢

EnVision多標(biāo)記微孔板檢測儀是目前檢測速度快的高通量檢測儀之一，所有檢測技術(shù)都是模塊化設(shè)計，用戶可根據(jù)需要自由選取適合的檢測模塊，如以后有新的應(yīng)用需求和通量要求，可以在用戶實驗室進(jìn)行現(xiàn)場升級。作為行業(yè)的產(chǎn)品，在光路設(shè)計和附件配置方面均有到之處，為用戶提供更靈敏、更快速、更靈活的檢測體驗。

1. 標(biāo)記物特異的濾光片/二向色鏡模塊

EnVision多標(biāo)記檢測儀采用濾光片/二向色鏡模塊光路，其優(yōu)勢是把激發(fā)光和發(fā)射光完全分離開，避免了檢測時的信號干擾，檢測的準(zhǔn)確性。所有濾光片/二向色鏡均配備條形碼，軟件可自動識別，避免了手動選取光學(xué)元件時出錯的可能性。

2. 四光柵檢測光路

激發(fā)和發(fā)射均采用雙光柵技術(shù)，在檢測靈敏度的同時大大降低背景信號，可進(jìn)行所用光吸收和熒光檢測。具有全波長掃描功能，可確定待測物質(zhì)的吸收峰值或熒光激發(fā)及發(fā)射峰值；具有很大的檢測靈活性。

EnVision的濾光片/二向色鏡與四光柵混合光路能大限度的兼顧檢測靈敏度和靈活性，并提供快的速度和高通量。

3. 低背景的雙檢測器

EnVision的頂部檢測光路采用全透鏡模式，不借助光導(dǎo)器或是光纖束，檢測速度更快、靈敏度更高。兩個溫度恒定的紅敏光電倍增管（PMT）檢測器滿足FRET、LANCE、BRET、雙報告基因等雙發(fā)射同時檢測分析的要求。

4. 超敏感化學(xué)發(fā)光

采用的檢測器更靠近樣品，立的光路設(shè)計有效避免相鄰樣本在檢測時的交叉干擾，僅需更少的細(xì)胞就能獲得比標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)發(fā)光更高的靈敏度，使原代細(xì)胞、干細(xì)胞或難轉(zhuǎn)染細(xì)胞的檢測也不再困難。



5. 溫度控制

溫度控制覆蓋整板區(qū)域，其范圍是室溫+2℃至50℃，并且在微孔板頂部有一加熱部件，可有效防止冷凝問題。另外有針對AlphaScreen檢測的溫控模塊，AlphaScreen檢測過程的穩(wěn)定性。
6. AlphaScreen

采用680nm激光源，立光路，立的PMT檢測器，激發(fā)孔的同時檢測后一孔，大大提高讀板速度，實現(xiàn)高通量檢測。

、設(shè)備應(yīng)用

蛋白/核酸定量檢測

1. 蛋白質(zhì)定量

Lowrry法——蛋白質(zhì)中含有酚基的酪氨酸，可與酚試劑中的磷鉬鎢酸作用產(chǎn)生藍(lán)色化合物，顏色深淺與蛋白含量成正比，在650nm處檢測吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。

Bradford法——蛋白質(zhì)與染料考馬斯亮藍(lán)G-250結(jié)合，在一定的線性范圍內(nèi)，反應(yīng)液595nm處吸光度的變化量與反應(yīng)蛋白量成正比，測定595nm處吸光度的增加即可進(jìn)行蛋白定量。

BCA法——BCA(bicinchonininc acid)與二價銅離子的硫酸銅等其他試劑組成的試劑，混合一起即成為蘋果綠，即BCA工作試劑。在堿性條件下，BCA與蛋白質(zhì)結(jié)合時，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+，一個Cu+螯合二個BCA分子，工作試劑由原來的蘋果綠形成紫色復(fù)合物，在562nm處檢測，大光吸收強度與蛋白質(zhì)濃度成正比。
2. 核酸定量
PicoGreen染料能特異的與雙鏈DNA（dsDNA）結(jié)合，OliGreen能特異的結(jié)合寡核苷酸（ssDNA）；雙鏈λDNA或核苷酸溶于10 mM Tris-HCl（1 mM EDTA，pH 7.5）緩沖液，分別加入熒光染料，在激發(fā)光485nm、發(fā)射光530nm條件下檢測熒光信號，核酸濃度和熒光強度成正比。


代謝研究

包括NADH檢測、堿性磷酸酶、蛋白酶活性、雙報告基因檢測、細(xì)胞色素P450基因表達(dá)等。

1. 堿性磷酸酶檢測

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）廣泛分布于機體各臟器器官中，通過水解磷酸單酯將底物分子上的磷酸基團去除，并生成磷酸根離子和自由的羥基，參與各種生化反應(yīng)。BBTP是一種非熒光物質(zhì)，當(dāng)堿性磷酸酶去除其磷酸基團，得到的產(chǎn)物BBT可發(fā)出很強的熒光信號；因此，BBTP可作為底物檢測堿性磷酸酶活性。檢測靈敏度可達(dá)0.5 pg/孔（3 amol/孔）。

2. 雙報告基因檢測

報告基因是用來檢測藥物作用后細(xì)胞內(nèi)相關(guān)蛋白表達(dá)水平或轉(zhuǎn)錄活性的變化的方法。雙報告基因?qū)嶒炏到y(tǒng)中，報告基因表達(dá)活力的相對改變與偶聯(lián)調(diào)控啟動子轉(zhuǎn)錄活力的改變相關(guān)，偶聯(lián)到組成型啟動子的第二個報告基因，提供轉(zhuǎn)錄活力的內(nèi)對照， 使測試不被實驗條件變化所干擾。本實驗采用螢火蟲熒光素酶，結(jié)合β-半乳糖苷酶（β-Gal）的雙報告基因系統(tǒng)。先在微孔板中加入20μl樣本溶液，再加入50μl熒光素試劑和50μl ATP，用檢測儀檢測1s，讀取化學(xué)發(fā)光信號。然后在微孔板中加入100μl β-Gal底物，孵育15min后，于570nm檢測吸光度?；瘜W(xué)發(fā)光信號值與熒光素酶活性成正比，同時β-Gal變化趨勢應(yīng)與熒光素酶一致。

細(xì)胞周期、細(xì)胞毒性、細(xì)胞凋亡方面的研究
包括細(xì)胞活力、氧應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞粘連、鈣離子檢測、CYP介導(dǎo)的藥物代謝、ATP檢測、蛋白質(zhì)羥基化、Caspase-3檢測等。

1. 細(xì)胞活力檢測——MTT法

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚（Formazan）并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。二甲基亞砜（DMSO）能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶聯(lián)檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與細(xì)胞數(shù)成正比。該方法已廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規(guī)模的抗腫瘤藥物篩選、細(xì)胞毒性試驗以及腫瘤放射敏感性測定等。

2. CYP介導(dǎo)的藥物代謝

細(xì)胞色素P450（CYP）是藥物代謝過程中的關(guān)鍵酶，藥物先導(dǎo)分子能否被CYP酶代謝、哪種CYP參與代謝以及先導(dǎo)分子是否會抑制CYP的形成，這些問題對于藥物ADME篩選至關(guān)重要。實驗通過熒光檢測快速篩選能抑制CYP2A5形成的先導(dǎo)分子；從小鼠肝臟微粒體獲取有活性的CYP2A5，香豆素作為底物能特異的被CYP2A5代謝。反應(yīng)開始前在微孔板中加入NADPH，37℃孵育10分鐘，以60μl 10%TCA終止反應(yīng)，再加入140μl甘氨酸-NaOH溶液（pH 10.4）增強熒光信號，在355nm激發(fā)光和460nm發(fā)射光條件下檢測代謝產(chǎn)物7-OH-香豆素的含量。先導(dǎo)分子對CYP2A5活性抑制作用越強，則檢測到的熒光信號越弱。
3. ATP檢測
三磷酸腺苷（ATP）是活細(xì)胞的能量儲存單元，在細(xì)胞中的含量比較穩(wěn)定，因此ATP的數(shù)量與活細(xì)胞數(shù)量有緊密的相關(guān)性。ATP檢測常用于細(xì)胞增殖、細(xì)胞毒性和細(xì)胞粘附研究。實驗時，在微孔板中加入25μl樣本和25μl細(xì)胞裂解液，應(yīng)用分液器每孔加入50μl熒光素酶試劑，延遲1s，檢測10s；ATP濃度與化學(xué)發(fā)光信號成正比，由此推算細(xì)胞活性。
4. Caspase-3檢測
凋亡是在不產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)的情況下，多細(xì)胞生物體清除損傷細(xì)胞的一種方式。半胱氨酸酶被稱為Caspase，在細(xì)胞凋亡初期扮演著重要角色，藥物有可能激活或抑制Caspase的產(chǎn)生。因此，在藥物研發(fā)和癌癥研究中，Caspase及其調(diào)控機制備受矚目。PerkinElmer公司開發(fā)了一種LANCE方法檢測Caspase-3的活性；其原理是，在Caspase-3的四肽底物一端標(biāo)記Eu，另一端偶聯(lián)能淬滅Eu熒光的基團QSY?7，當(dāng)樣本表現(xiàn)Caspase-3活性時，四肽底物上淬滅基團被切除，游離的Eu激發(fā)后發(fā)出熒光，通過熒光強度檢測，可計算樣本中Caspase-3的含量。此方法無需洗板，快速、靈敏、高信噪比，穩(wěn)定性、重復(fù)性好。

信號通路、GPCR研究

TR-FRET/LANCE檢測GPCR信號通路第二信使cAMP：標(biāo)記Eu的cAMP與攜帶ULight的抗體結(jié)合形成共振能量轉(zhuǎn)移對，當(dāng)內(nèi)源性的cAMP釋放后可以競爭結(jié)合其抗體，從而破壞熒光信號的傳遞，通過檢測665/615信號的改變，檢測內(nèi)源cAMP的含量。LANCE檢測方法與傳統(tǒng)ELISA方法相比，均相免洗、操作步驟簡單、具有更高的檢測靈敏度和信噪比。

橫河eja壓力變送器的校準(zhǔn)需要用一臺標(biāo)準(zhǔn)壓力源輸入變送器,因為不使用標(biāo)準(zhǔn)器而調(diào)量程(LRV、URV汴是校準(zhǔn)，忽略輸入部分(輸入變送器的壓力)來進(jìn)行輸出調(diào)節(jié)(變送器的轉(zhuǎn)換電路)不是正確的校準(zhǔn)。


再者壓力、差壓檢測部件與A/D轉(zhuǎn)換電路、電流輸出的關(guān)系并不對等，校準(zhǔn)的目的就是找準(zhǔn)三者的變化關(guān)系。此外，只有對輸入和輸出(輸入變送器的壓力、A/D轉(zhuǎn)換電路、環(huán)路電流輸出電路)一齊調(diào)試， 才是真正意義上的校準(zhǔn)。


橫河eja壓力變送器的壓力源通過膠皮管與自制接頭相連接，關(guān)閉平衡閥門，并檢查氣路密封情況，然后把電流表(電壓表)、手操器接入變送器輸出電路中，通電預(yù)熱后開始校準(zhǔn)。


對差壓變送器進(jìn)行校準(zhǔn)時，先把三閥組的正、負(fù)閥門關(guān)閉，打開平衡閥門，然后旋松排氣、排液閥或旋塞放空，然后用自制的接頭來代替接正壓室的排氣、排液閥或旋塞；而負(fù)壓室則保持旋松狀態(tài)，使其通大氣。一、目的：

當(dāng)變送器在使用過程中遭遇進(jìn)水后，應(yīng)根據(jù)現(xiàn)場變送器被侵蝕的具體情況進(jìn)行判斷，是否可以繼續(xù)使用。以下主要說明在此種情況下的檢查步驟，以助盡快得出結(jié)論，恢復(fù)生產(chǎn)。



二、檢查步驟：

1）先判斷變送器進(jìn)水情況

一般可能存在的幾種可能：

A）前腔體（顯視屏側(cè)）進(jìn)水

B）后腔體（接線端子側(cè)）進(jìn)水

C）容室法蘭（引壓側(cè)）內(nèi)進(jìn)入泥沙2）從安裝位置拆下變送器

先確認(rèn)變送器供電電源已斷電，然后打開后蓋，如果有積水，須清理干凈。

再拆下變送器接線端子的連線。

拆下引壓管或安裝法蘭后，將變送器從安裝位置取下。



3）在校驗室進(jìn)行具體檢查

A）前腔體（顯視屏側(cè)）進(jìn)水，將積水清除，返回工廠檢查。

B）后腔體（接線端子側(cè)）進(jìn)水，先將積水清除，在確認(rèn)前腔體沒有進(jìn)水的情況下，通電檢查顯示、電流等，無異常時檢查通訊，有條件，加壓合格，可以繼續(xù)使用。

C）容室法蘭內(nèi)進(jìn)入泥沙，可用水小心清洗，確保清理干凈后加壓，合格，可繼續(xù)使用。

1、內(nèi)部校準(zhǔn)和自校準(zhǔn)的區(qū)別

“自校準(zhǔn)”一般是利用測量設(shè)備自帶的校準(zhǔn)程序或功能(比如智能儀器的開機自校準(zhǔn)程序)或設(shè)備廠商提供的沒有溯源證書的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行的校準(zhǔn)活動，通常情況下，其不是有效的量值溯源活動，但特殊領(lǐng)域另有規(guī)定除外。

“內(nèi)部校準(zhǔn)”是指在實驗室或其所在組織內(nèi)部實施的，使用自有的設(shè)施和測量標(biāo)準(zhǔn)，校準(zhǔn)結(jié)果僅用于內(nèi)部需要，為實現(xiàn)獲認(rèn)可的檢測活動相關(guān)的測量設(shè)備的量值溯源而實施的校準(zhǔn)。

因此符合要求的內(nèi)部校準(zhǔn)是CNAS認(rèn)可的溯源途徑，而自校準(zhǔn)不是。



2、內(nèi)部校準(zhǔn)適用范圍

對于取得CNAS認(rèn)可的檢測實驗室，或準(zhǔn)備申請CNAS認(rèn)可的檢測實驗室，與其獲得或申請的認(rèn)可能力有關(guān)的測量設(shè)備，如果量值溯源是通過內(nèi)部校準(zhǔn)的途徑，則滿足CNAS－CL31∶2011《內(nèi)部校準(zhǔn)要求》。

但是如果實驗室與其獲得或申請的認(rèn)可能力有關(guān)的測量設(shè)備內(nèi)部校準(zhǔn)能力，已獲得CNAS校準(zhǔn)實驗室認(rèn)可或取得法定計量檢定機構(gòu)授權(quán)的，則可以認(rèn)為能滿足《內(nèi)部校準(zhǔn)要求》而不需再按CNAS－CL31∶2011《內(nèi)部校準(zhǔn)要求》進(jìn)行評審。例如有的實驗室玻璃量器比較多，如果全部送檢，費用大且周期長，影響了檢測工作，該實驗室向省級計量行政主管部門申請建標(biāo)并且通過考核，取得了玻璃量器的計量標(biāo)準(zhǔn)考核證書，則可以認(rèn)為該實驗室對玻璃量器的內(nèi)部校準(zhǔn)是符合CNAS要求的量值溯源途徑。相關(guān)法規(guī)規(guī)定屬于強制檢定管理的測量設(shè)備，應(yīng)按規(guī)定檢定，不能進(jìn)行內(nèi)部校準(zhǔn)。



3、對人員的要求

從事內(nèi)部校準(zhǔn)的人員應(yīng)有相應(yīng)的物理、數(shù)學(xué)知識，計量學(xué)知識及測量不確定度的評定能力。內(nèi)部校準(zhǔn)的人員，應(yīng)經(jīng)過相關(guān)計量知識、校準(zhǔn)技能等必要的培訓(xùn)、考核合格并持證或經(jīng)授權(quán)。



4、對環(huán)境條件和設(shè)施的要求

實驗室實施內(nèi)部校準(zhǔn)的校準(zhǔn)環(huán)境、設(shè)施應(yīng)滿足校準(zhǔn)方法的要求。

應(yīng)確保其環(huán)境條件不會使結(jié)果無效，或?qū)λ蟮男?zhǔn)質(zhì)量產(chǎn)生不良影響。

對影響內(nèi)部校準(zhǔn)結(jié)果的設(shè)施和環(huán)境條件的技術(shù)要求應(yīng)制定成文件。

當(dāng)內(nèi)部校準(zhǔn)方法有要求，或?qū)Y(jié)果的質(zhì)量有影響時，實驗室應(yīng)監(jiān)測、控制和記錄環(huán)境條件。當(dāng)環(huán)境條件危及到內(nèi)部校準(zhǔn)的結(jié)果時，應(yīng)停止校準(zhǔn)。



5、對內(nèi)部校準(zhǔn)所用設(shè)備及參考標(biāo)準(zhǔn)的要求

實施內(nèi)部校準(zhǔn)應(yīng)按照校準(zhǔn)方法要求配置和使用參考標(biāo)準(zhǔn)和/或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(計量標(biāo)準(zhǔn))以及輔助設(shè)備，其量值溯源應(yīng)滿足CNAS－CL01《檢測和校準(zhǔn)實驗室能力認(rèn)可準(zhǔn)則》第5.6條“測量溯源性”的要求和CNAS－CL06《量值溯源要求》的要求。為確保校準(zhǔn)的正確性和可靠性，對參考標(biāo)準(zhǔn)和/或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(計量標(biāo)準(zhǔn))的建立、考核、維護和正確使用應(yīng)制定的程序。

應(yīng)按照規(guī)定的程序和日程對參考標(biāo)準(zhǔn)和/或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(計量標(biāo)準(zhǔn))進(jìn)行核查，以保持其校準(zhǔn)狀態(tài)的置信度。

參考標(biāo)準(zhǔn)和/或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(計量標(biāo)準(zhǔn))應(yīng)進(jìn)行測量不確定度驗證、重復(fù)性考核和穩(wěn)定性考核。



6、對校準(zhǔn)方法的要求

計量設(shè)備的內(nèi)部校準(zhǔn)方法應(yīng)采用國家校準(zhǔn)規(guī)范或部門校準(zhǔn)規(guī)范，在沒有校準(zhǔn)規(guī)范的情況下，等同采用相應(yīng)的國家檢定規(guī)程或部門檢定規(guī)程。

在沒有相應(yīng)的校準(zhǔn)規(guī)范或檢定規(guī)程或其他標(biāo)準(zhǔn)方法時，實驗室可以使用自編方法、測量設(shè)備制造商推薦的方法等非標(biāo)方法，使用測量設(shè)備制造商推薦的方法時應(yīng)轉(zhuǎn)化為實驗室文件。非標(biāo)方法應(yīng)進(jìn)行方法確認(rèn)，保存方法確認(rèn)的記錄。



7、內(nèi)部校準(zhǔn)的質(zhì)量控制

實驗室的質(zhì)量控制程序、質(zhì)量監(jiān)督計劃應(yīng)覆蓋內(nèi)部校準(zhǔn)活動。參考標(biāo)準(zhǔn)和/或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(計量標(biāo)準(zhǔn))應(yīng)參加CNAS承認(rèn)的實驗室間的比對或測量審核或能力驗證計劃。



8、不確定度要求

實驗室應(yīng)對開展的全部內(nèi)部校準(zhǔn)項目(參數(shù))評估測量不確定度，應(yīng)在校準(zhǔn)證書或記錄中報告測量不確定度和(或)給出對其計量規(guī)范或相應(yīng)條款的符合性聲明。一般情況下，校準(zhǔn)結(jié)果應(yīng)包括測量結(jié)果的數(shù)值y和其擴展不確定度U。應(yīng)在校準(zhǔn)證書中注明不確定度的包含因子和包含概率，可以使用以下文字描述:“本報告中給出的擴展不確定度是由標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含概率約為95%時的包含因子k?！睌U展不確定度的數(shù)值應(yīng)不超過兩位有效數(shù)字，并且應(yīng)滿足以下要求:

1) 終報告的測量結(jié)果的末位，應(yīng)與擴展不確定度的末位對齊;

2) 應(yīng)根據(jù)GB/T8170《數(shù)值修約規(guī)則與極限數(shù)值的表示和判定》的規(guī)則進(jìn)行數(shù)值修約。在校準(zhǔn)證書中報告測量不確定度的來源時，應(yīng)包含校準(zhǔn)期間短期的不確定度分量。



9、內(nèi)部校準(zhǔn)的記錄及報告

內(nèi)部校準(zhǔn)的校準(zhǔn)證書可以簡化，或不出具校準(zhǔn)證書，但校準(zhǔn)記錄的內(nèi)容應(yīng)符合校準(zhǔn)方法和認(rèn)可準(zhǔn)則的要求。校準(zhǔn)記錄應(yīng)有較長的保存期，以監(jiān)視被校準(zhǔn)測量設(shè)備的穩(wěn)定性。

校準(zhǔn)人員的校準(zhǔn)結(jié)果經(jīng)過校核人員的核驗。校準(zhǔn)記錄中應(yīng)包含所用計量標(biāo)準(zhǔn)名稱及其性編號，以確保校準(zhǔn)過程的復(fù)現(xiàn)。



10、內(nèi)部校準(zhǔn)在CNAS認(rèn)可活動中的要求

在初審、復(fù)評和擴項評審時，如果申請認(rèn)可的檢測能力存在內(nèi)部校準(zhǔn)活動時，實驗室在申請書中申報，CNAS將安排相關(guān)校準(zhǔn)領(lǐng)域的評審員，參加現(xiàn)場評審，評審結(jié)果實驗室內(nèi)部校準(zhǔn)能力不符合要求時，申請認(rèn)可的相關(guān)檢測項目或參數(shù)不予認(rèn)可。

如果實驗室存在內(nèi)部校準(zhǔn)活動，但申請時未報的，現(xiàn)場評審中，評審組內(nèi)無相關(guān)內(nèi)部校準(zhǔn)的評審能力時，申請認(rèn)可的相關(guān)檢測項目或參數(shù)不予認(rèn)可。監(jiān)督評審中，應(yīng)覆蓋內(nèi)部校準(zhǔn)活動，一般情況下，內(nèi)部校準(zhǔn)能力的覆蓋范圍與認(rèn)可的檢測能力的監(jiān)督范圍一致。內(nèi)部校準(zhǔn)的結(jié)果只能在實驗室內(nèi)部使用，不能對外宣稱內(nèi)部校準(zhǔn)項目獲得CNAS認(rèn)可或使用認(rèn)可標(biāo)識。